鑒于二氧化碳培養箱在使用過程中會伴隨著微生物滋生，為確保培養箱免受污染，細胞能擁有安全的生長環境，出現了各種滅菌方法：如紫外滅菌消毒、HEPA過濾除菌、液體消毒劑及加熱滅菌等。
01紫外滅菌消毒
難以清除二氧化碳培養箱風道等避光處污染，且紫外燈光線會隨時間而衰減，滅菌效果較差。
02HEPA過濾器除菌
內部增加HEPA濾膜，箱內不銹鋼內膽光滑表面等都具有污染物防護作用。
03二氧化碳培養箱液體消毒劑
簡易的消毒方法，有一定的效果但不能保證滅菌。
相較而言，加熱滅菌方式是比較有效的方法，分為濕熱滅菌和干熱滅菌兩種，目前市面上最常見的是90度濕熱滅菌和140度干熱滅菌兩種。
01二氧化碳培養箱濕熱滅菌
濕熱滅菌指溫度超過100℃后水轉變為水蒸汽并產生高壓強，對微生物進行高壓及穿透性導熱滅菌，而培養箱使用90℃濕熱滅菌通常無法達到理想的滅菌效果。
02二氧化碳培養箱干熱滅菌
干熱滅菌是通過高溫使蛋白質及核酸變性失活，達到殺滅的目的，但干熱140度仍會存在滅菌不的情況，部分芽孢和孢子可能無法滅活。